Bagaimana Southern Blotting Bekerja - Perbedaan Antara

Bagaimana Southern Blotting Bekerja

Southern blotting adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA spesifik dalam sampel. Teknik blotting melibatkan pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel, mentransfer sampel DNA ukuran-difraksionasi ke membran filter, hibridisasi fragmen DNA spesifik dengan penyelidikan, penyelidikan spesifik urutan, dan mendeteksi band berlabel.

Selain identifikasi DNA spesifik dalam sampel, ukuran dan kelimpahan jenis DNA tertentu juga dapat ditentukan dengan Southern blotting. Proses yang terlibat dalam Southern blotting dijelaskan dalam artikel ini.

Bidang-bidang Utama yang Dicakup

1. Apa itu Southern Blotting
- Definisi, Prinsip, Aplikasi
2. Bagaimana Southern Blotting Bekerja
    - Proses Southern Blotting

Kata Kunci: DNA, Gel Elektroforesis, Probe Hibridisasi, Membran Nylon, Pencernaan Terbatas, Southern Blotting 


Apa itu Southern Blotting

Southern blotting adalah teknik hibridisasi yang digunakan dalam identifikasi DNA spesifik dalam sampel. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Edward M. Southern pada tahun 1975. Proses ini mengidentifikasi urutan DNA, ukuran, dan kelimpahan urutan DNA tertentu dalam sampel.

Membran Southern blotting ditunjukkan pada Gambar 1.


Gambar 1: Membran Blotting Selatan

Aplikasi Southern Blotting

Aplikasi Southern blotting dijelaskan di bawah ini.

  1. Untuk mendeteksi fragmen DNA tertentu
  2. Untuk mengisolasi fragmen DNA tertentu
  3. Untuk mengidentifikasi mutasi dan penyusunan ulang gen
  4. Dalam uji RFLP (pembatasan polimorfisme panjang fragmen)
  5. Untuk mengidentifikasi penyakit genetik
  6. Untuk mengidentifikasi agen infeksi
  7. Pengujian ayah
  8. Dalam sidik jari DNA untuk mengidentifikasi penjahat

Bagaimana Southern Blotting Bekerja

Southern blotting melibatkan pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran melalui elektroforesis gel, mentransfernya ke membran, hibridisasi dengan label, urutan spesifik penyelidikan, dan mendeteksi band berlabel. Langkah-langkah Southern blotting dijelaskan di bawah ini.

  1. Pencernaan DNA - Sampel DNA dicerna oleh enzim restriksi untuk mendapatkan fragmen DNA, dan fragmen ini diperkuat oleh PCR.
  2. Elektroforesis gel - Fragmen DNA berukuran difraksinasi oleh elektroforesis gel.
  3. Denaturasi - Gel dengan DNA terfraksionasi direndam dalam NaOH atau HCl untuk mendenaturasi untai ganda.
  4. Mengotori - Fragmen DNA dalam gel ditransfer ke membran nilon bermuatan positif oleh proses yang disebut blotting.
  5. Memanggang dan memblokir - Kertas blotting dengan fragmen DNA dipanggang untuk memperbaiki DNA pada membran. Kemudian, situs pengikatan yang tidak dihuni jenuh dengan mengobati dengan Bovine serum albumin (BSA) atau kasein.
  6. Hibridisasi dengan probe berlabel - membran terikat DNA diperlakukan dengan probe berlabel yang mengandung urutan nukleotida komplementer untuk fragmen DNA yang tertarik.Probe hibridisasi umumnya panjang 100-500 pb, dan dilabeli dengan nukleotida radioaktif.
  7. Visualisasi dengan autoradiogram - Membran probe terikat divisualisasikan di bawah autoradiogram untuk mendapatkan pola fragmen DNA yang tertarik.


Gambar 2: Southern Blotting

Seluruh proses Southern blotting ditunjukkan pada Gambar 2.

Kesimpulan

Southern blotting adalah teknik hibridisasi yang digunakan dalam identifikasi urutan DNA spesifik dari sampel. Dalam proses ini, sampel DNA difraksionasi oleh enzim restriksi, dan campuran dijalankan pada gel. Kemudian, pola pita pada gel ditransfer ke membran nilon dan diseragamkan dengan probe berlabel, yang memungkinkan deteksi fragmen yang tertarik.

Referensi:

1. "Southern Blotting."Thermo Fisher Scientific,